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故而可以在贯叶金丝桃素的甲醇溶 液中加入三氟

发布:admin04-22分类: 贯叶金丝桃价格

  含量约为全草的0.059%~0.35%,饱和 烃有2-甲基庚烷(16.4%),单萜有α-蒎烯、β-蒎烯等,倍半萜有丁子香烯(caryophyllen e)和草烯(humulene),还有痕量的2-甲基丁烯醇、2-甲基癸烷和多种n-烷醇。

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  摘要fj 惯叶连翘Hypericum perforatum Linn为藤黄科Garcinia金丝桃属 Hypericaceae植物,是我国传统的中药材,在欧洲及美国被称为圣约翰草 St.John’wort,用于治疗抑郁症有几百年的历震。近几年研究发现,贯叶金 丝桃素是贯叶连翘中抗抑郁的主要活性成瑚i本文对贯叶金丝桃素的定性定 量分析方法和提取纯化方法进行了研究。本文主要研究内容如下: 1)建立了一个新的贯叶金丝桃素的高效薄层色谱和薄层色谱定性分析 方法,为国内首次报道。薄层色谱的最佳条件为:以薄层层析硅胶GF254为 固定相,以正己烷一乙酸乙酯(5:1,v/v)为展开剂,贯叶金丝桃素的R, 值为0.4l。 2)建立了一个新的贯叶余丝桃素的反相高效液相色谱定量分析方法。 高效液相色谱的分析条件为;固定相为AlltimaC.。柱;A溶液:80%甲醇 +1%乙酸,B溶液:甲醇,采用梯度洗脱:Omin~10rain,0%B~100%B; 10min~40min,100%B;流速为lmL/min;柱温为30:检测器为UV检测 器(270hm)。贯叶金丝桃素可达到基线分离的要求,它的保留时间为 14.Omin。线.34%,当信噪比为3:1时,最小检测限为7.3410。7“g。 3)进行了贯叶金丝桃素的提取和粗分离方法的研究。采用超声波强化 提取的方法。采用薄层制各色谱对贯叶连翘粗提物中的贯叶金丝桃素进行纯 化。最佳制备薄层色谱条件为:固定相为薄层层析硅胶GF254,展开剂为正 己烷一乙酸乙酯(4.5:l,v/v),纯化后贯叶金丝桃素样品的纯度为76.64 %。进行了用常压硅胶柱层析技术分离制备贯叶金丝桃素的研究,优化了分 离条件.以柱层析硅胶为固定相,以_i:F己烷一乙酸乙酯(6:1,v/v)为流 动相进行洗脱,分步收集,合并相同组分。得到的贯叶金丝桃素样品的纯度 为61,14%。 4)首次采用干柱层析对贯叶连翘粗提物中的贯叶金丝桃素进行纯化, 该方法国内外尚未见报道。固定相为薄层层析硅胶GF254,流动相为正己烷 一乙酸乙酯(4.5:l,v/v)。纯化后的贯叶金丝桃素样品的纯度为72.13%。5)使用制备薄层色谱法和加压型制冬液相色谱联用的方法制各高纯度 贯叶金丝桃素样品。其纯度大于98%。 6)采用EST--BS对样品进行分析鉴定。样品的Ms谱与文献中贯叶金 丝桃素Ms谱一致,可确定制备的样品为贯叶余丝桃素,并且提出了贯叶金丝 桃素分子的可能裂解过程。 关键词:贯叶连翘贯叶会丝桃素薄层色谱高效液相色谱制备 II ABSTRACTHypericumperforatum Linn,a plant Garciniafamily,is oneofChinese traditionalmedicines.ItisalsonamedStJohn’swortin Europe andAmerica.It hasbeenusedtOtreat depression forhundred years.Recentlypharmacological andclinical studiesin St.John’S wortindicated hyperforin the‘true’activecomponent withthe antidepression properties.In papertheanalyticalmethodsand preparation hyperforinwerestudied.Themaincontentsofthis paper wereasfollows: novelhighperformance thin layerchromatographic(HPTLC)and thin layerchromatographic(TLC)methods qualitativeanalysehyperforinwere developednovelly inChina.The optimal conditionsofTLCwereasfollows: silica gel GF254as stationaryphase,n—hexane--ethylacetate(5:1,v,v)as mobile phase.The Rf valueof hyperforin was0.41 newmethodofthe reverse phase high performance liquid chromatography(HPLC)determination hyperforinWas developed.The optimal HPLCconditionswereasfollows:Alltima Cts columnasthe stationary phase,gradientelution,A solvent:80%methanol+1%aceticacid,Bsolvent: methanol,0min~10min,O%B~100%B,10min~40min,100%B,1mL/min flowrate,30of column temperature,UVdetector(270nm).Under conditions,abaseline separation hyperforinwasobtainedandtheretention timeof hyperforin 14.0minutes.Thecalibration equation M21.3238A一0.013921.TherelatedcoefficientrisO.9993.thelinear rangeis 0.5u gt010u g.when signal-to—noiseratiowas 3:1,theLODwas7.341 0。“g.The RSD is1.14%The averagerecovery is98.34%. 3)Extraction hyperforinfrom Hypericumperforatum werestudied.The extractionwasintensified ultrasonicmethod.Thenthe crudeextracts hyperforinwasobtained.The separation hyperforinfromcrudeextracts preparativethin layer chromatography(PTLC)was studied.The optimal 1II conditionsofPTLCwereasfollows:silica gel GF254as stationaryphase; n—hexane--ethylacetate(4.5:1,v/v)as mobile phase,Thepurity hyperforinwas76.64%.The separation hyperforinfromcrudeextractswithsilicacolumn chromatography studied,Theoptimal conditions silicacolumn chromatography wereasfollows:column chromatography silica gel stationaryphase,n-hexane--ethylacetate(6:1,V/v)as mobile phase,fractivelycollection, combining sameconstituents.Thepurity separatedhyperforin 61.14%,4)Theseparation hyperforinfromcrudeextracts drycolumn chromatography wasstudied firstly.The optimal conditionsof dry column chromatography wereasfotlows:silica gel GF254 asstationaryphase,n—hexane --ethyl acetate(4.5:1,v/v)as themobile phase,thepurity hyperforinWas 72.13%. 5)By combination ofPTLCand preparative high performanceliquid chromatography(PHPLC),a high purityhyperforinsample wasobtained.The purity higherthan98% 6)Theproduct wasidentifiedas hyperforin ESI—MS.TheESI+一MSandESI一一MS spectrum ofthe product wasinaccordwithliteratures.The ESI—MSwaselucidated andthe fragmentationpathway suggested.KEYWORDS Hypericumperforatum,hyperforin,TLC,HPLC,preparation IV 作者声明本人郑重申明:本人恪守学术道德,崇尚『iP=谨学风。所呈交的论文是我个人 在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了文中特别加以 标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,办不 包括为获得南京工业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了 谢意。 签名:纽虹日期:鳗,[ 关于论文使用授权的说明 本人完全了解南京工业大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权 保留送交论文的复印件,允F}:论文被查阅和借阅i学校可以公布论文的全部或部 分内容,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密的论文在解密后应遵守此规定。 签名:鎏刍i垦导师签名:声瘗.5垒,一日期 关于知识产权的声明 本论文取得的研究成栗(包括提出的创新构思、得到的实验规律和科学结论 等),其知识产权全部归南京工业大学所有。本文作者只能以南京工业大学为第 完成单位发表本论文的研究成果。其他个人及单位未征得南京工业大学的许 可,不得以任何方式使用本论文的研究成果。违反上述规定者将承担相应的法律 责任。 签名:!盎塔蔓 导师签名:{庭i兹 日期:Q虹 1.1本课题的研究背景I.1.1贯叶连翘及其资源分御 第一章绪论 1.1.1.1贯叶连翘简介 贯叶连翘HypericumperforatumLinn为藤黄科Garcinia金丝桃属 Hypericaceae植物,多年生草本…,在欧洲及美国被称为圣约翰草s}.John’s 盯f,这种植物通常在6月24同前后开花,花瓣呈黄色。由于该日是圣经记载中 施洗者圣约翰的诞生日期,且这植物含有红色液汁,当时的人们认为这是圣约翰 殉道时流出的血液,为此人们认为这种植物具有神奇的力量。中古时代的人们相 信圣约翰草有医疗作用和驱走邪魔的作用【2】。贯叶连翘为高20~60厘米,茎直 立,多分枝,茎及分枝两侧各有一纵线棱。叶无柄,彼此靠近密集,椭圆形至线厘米,背卷,上面绿色,下面白绿色,全面散布 淡绿色但有时为黑色的腺点。花序为聚伞状花序,生于茎及分枝两端。花瓣黄色, 长圆形或椭圆形,两侧不相等。蒴果卵珠形,长约5毫米,宽3毫米,具背生腺 条及侧生黄褐色囊状腺体。种子黑褐色,圆柱形,长约1毫米,花期?-8月,果 期9—10月13j。其形态见图卜l。 贯叶连翘生长于海拔800—2100米的山地灌丛、草丛及路旁,喜温暖、湿 润的环境,耐寒。贯叶连翘属温带植物,分布范围很广,国外主要分布与于南欧、 非洲西北部、近东、中亚、印度、蒙古、前苏联等,国内产于山东、河南、河北、 陕西、山西、甘肃、新疆、江西、江苏、四川、湖南、湖北、贵州等地【4J。 ——果实——叶片 1.1.2贯叶连翘的化学成份南。j:贯叶连翘具有重要的药理作用,故其化学成分的研究也一直是热点,围 内外学者对此进行了大量的研究。贯叶连翘的主要化学成分已被分离鉴定‘5焖, 一般认为其主要成分包括:黄酮类化合物(flavonolglycosides)、萘骈双蒽酮 类化合物(naphtodianthrones)、藤黄酚类衍生物(pholoroglucinols)和挥发 1)黄酮类化合物[710】 目前研究表明贯叶连翘中的黄酮类化合物主要有芦丁(Rutin)、金丝桃甙 (Hyeroside)、异槲皮甙(Isoquercitrin)、槲皮甙(Quercitrin)、槲皮素 (Quercetin)等。 (分子结构式见图1--2)。 RutinR=G1u--Rha 金丝桃甙Hyeroside R=Gla 异槲皮甙Isoquercltrin R=Glu QuercitrinR=Rha 图I--2贳11’}连翘中黄酮类化合物分子结构式Fig.1——2 YolecHlarStructureofflavonol glycosidesinHypericumperfortumL. 黄酮类化合物和原花青素(包括二聚体、三聚体和四聚体以及儿茶精和表儿 茶精的多聚体)的含量在发芽期和开花前最高,达11.7%,其次为叶和茎,含 量为7.4%。花中金丝桃甙的含量最高,为3%,其次为叶,含量为1.05%~1.8 %。叶和花中含有槲皮素0.1%~0.582%。植株的所有部位皆含有芦丁,发芽 期叶中的含量为2%,高于花中含量(0.095%)。据文献报道,在贯叶连翘中黄 酮类化合物主要还包括槲皮甙(0,3~O.524%)、异槲皮甙(0.3山柰酸、木犀 草素、杨梅黄素、阿曼托黄素(0,l~O.5%)等。 2)萘骈双葸酮类化合物叫 目前研究表明,贯叶连翘中萘骈双蒽酮类化合物主要有伪会丝桃素 (Pseudohypericin)、金丝桃素(HyDericin)等。(分子结构式见图1~3)。 在花瓣中会丝桃素的含量最高,达0.245%,干燥花含金丝桃素7.8%,伪 会丝桃素的含量是金丝桃素的2~3倍。鲜植物中含有原金丝桃素和原伪金丝桃 素,它们在阳光下可分别转化为会丝桃素和伪金丝桃素。植物中还存在伪会丝桃 素的氧化产物环伪龠丝桃素。 OHH3R OH OH金丝桃素Hypericin R=CH3 伪金丝桃素PseudohypericinR=CH20H 图卜3伪金丝桃系和金丝桃桑的分子结构式 Fig.1—3 M01ecularStructureofHyperiainand Pseudohy口eriCin 3)藤黄酚类衍生物【12~131 藤黄酚类衍生物也就是间苯三酚衍生物,主要是间苯三酚的异戊二烯的衍生 物组成。目前研究表明,贯叶连翘中滕黄酚衍生物主要有贯叶金丝桃素 (Hyperforin)、加贯叶会丝桃(Adhyperforin)(分子结构式见图卜4)。藤黄酚 类衍生物几乎只存在于贯叶连翘的花和朔果中,贯叶金丝桃素的含量约为2.O~ 4.5%,加贯叶金丝桃素的含量为0.2~1.9%。这类物质极不稳定,在光、热和 氧气的条件下很容易被氧化,采摘及保存不当都会损失。 贳叶金丝桃素Hyperforin R=tt 加贯n1金丝桃AdhyperforinR=CHa 圈卜4贯叶金丝桃索和加贯nt‘金丝桃素的分子结构式 4)挥发油‘”1挥发油含量为0,059%~0,35%,主要为单萜类化合物(蒎烯)和倍半萜 类化合物,饱和烃有2一甲基庚烷(】6.4%)和。一蒎烯(10.6%)。其他还有。 一甲基一癸烷、a一甲基一丁烯、十一烷、B一蒎烯、a一萜烯醇、月桂烯、石竹 烯、萑草烯以及十六碳和二十四碳n一烷烃、二十四碳、二十六碳和二十八碳一 5)其他化台物【151贯叶连翘中的还含有其他成分:碳氢化合物、原花青素、胆碱类、胡萝h 素、B一谷甾醇、异缬草酸、月桂酸、肉豆蔻酸、烟酸、棕榈酸、硬酯酸、氨基 酸、果胶、维生素c等。此外,全草含鞣质10%,树脂中含有抗菌成分贯叶连 翘树脂。 【.1.3贯叶连翘的药理作用 贯叶连翘又名元宝草、赶山鞭等,是我国传统的中药材。最早被《本草纲目 拾遗》所记载,中医认为其性味辛、涩苦、平,具有清热解毒、收敛止血、利湿 等功效。现代临床医学证明,贯叶连翘具有抗抑郁、抗病毒、抗癌、抗菌及镇痛 等功效。 贯叶连翘在我国民间有2400多年的药用历史,在德国用于治疗抗抑郁症已 有几百年历史【16】。目前,贯叶连翘提取物在欧美因其疗效显著、副作用小、使 用安全,已成为治疗抑郁症的首选药,并已被德国、美国等国收录药典。美国药 典(USP)中,贯叶连翘提取物的质量标准为贯叶金丝桃素(Hyperforin)的含量 不得低于3%,金丝桃素(Hypericin)的含量不锝低于0.3%【17]o 现代科学研究表明贯叶连翘中的主要活性成分为贯叶金丝桃索、金丝桃素、 金丝桃甙、槲皮素、异槲皮素、槲皮甙、芦丁等。 1)贯叶连翘的抗抑郁作用 贯叶连翘提取物在欧洲(尤其是德国)长期被用作抗抑郁药物,但关于其机 制和有效成分的研究目前仍在探索中。 近年来出于贯叶连翘及贯叶连翘提取物显著的抗抑郁作用,引起了全世界的 关注。多项动物模型试验‘堪 ̄20】(悬尾试验、孔扳试验、强追游泳试验、获得性 无助、逃跑缺逸等)证明贯叶连翘提取物具有抗抑郁作用。临床试验结果表明, 贯叶连翘提取物的抗抑郁疗效对轻度和中度抑郁症患者的疗效明显优于安慰剂”“,与三环类抗抑郁药和选择性单胺重吸收抑制剂(SSRI)的抗抑郁疗效相似[22】, 但贯叶连翘提取物的副作用更小,治疗费用更小,明显优于一般常用抗抑郁药。 原来认为,贯叶连翘中抗抑郁的有效成分是金丝桃素,它通过MA0I(单胺 氧化酶抑制剂)机制起作用。而最新的药理学研究表明,贯叶连翘提取物中的主 要抗抑郁活性物质是贯叶金丝桃素。贯叶金丝桃素的抗抑郁机制目前尚不清楚。 体内体外试验123】发现,贯叶金丝桃素被是神经递质5一羟色胺(5--HT)、多巴胺 (DA)、去甲肾上腺素(NE)的非竞争性重吸收抑制剂,贯叶金丝桃索还可以抑 制突触体对v氨基丁酸(GABA)和L一谷氨酸(L—glu)的重吸收。它的作用机 制和常用抗抑郁药不同,它是广谱的非竞争性的抗抑郁药,研究表明它的作用很 可能是通过提高突触体细胞内钠离子浓度‘241或通过降低突触体内突触小泡的跨 膜pH梯度例实现的。 2)抗菌作用 贯叶连翘的醇提取物对革兰氏阳性菌有抗菌效力,其荚皮(果皮)的丙酮提 取物在稀释倍数小于1:200000时对葡萄球菌有抑菌作用,而在稀释倍数为1: 20000时有杀菌作用。另据报道抗菌的有效成分为两种高度不饱和树脂,对肺炎 球菌,溶血性链球菌均有作用:根、花有抗结核杆菌的作用[26,七71。 贯叶连翘中的一种多酚类化合物可激活单核吞噬细胞等自细胞。一种油溶性 组分有温和的免疫抑制功能,可抑制白介素一6的释放。活体试验表明,贯叶连 翘冷冻干制品具有能够抑制炎症和白细胞浸润的作用‘2 81。 3)贯叶连翘的抗病毒作用 离体和活体试验【29]表明,金丝桃素可抑制HIV及其它一些反转录病毒。金 丝桃素体外试验对单纯疱疹病毒l型、2型(HSV—l,HsV一2),副流感病毒, 牛痘病毒,疱疹口炎病毒有抑制作用,抑制浓度分别为O.2,<0.1,0.1,1.0 g/mL,对人体巨噬细胞病毒体外试验也有抑制作用,EDso为0.8la g/mL。 根据De Clercq的观点,破坏HIV的复制循环有10个攻击目标,包括吸附、 融合、脱壳、反转录、整合、DNA复制、转录、翻译、装配和释放。金丝桃素 不影响病毒的转录和翻译而是干扰病毒的装配与释放口…。另外,H一1 cDNA 离体试验”表明,金丝桃素可抑制从HIV病毒感染细胞中分离的整合酶。因此 金丝桃素可能也影响病毒的整合。 盒丝桃素的抗病毒机制与其光敏性有关。光照条件下,金丝桃素吸收光子,然后激发单线态氧,释放能量。产生单线态氧进而破坏细胞膜,干扰蛋白质和核 酸【32】。 4)贯叶连翘的抗癌作用 癌症的光化学治疗(PCT)是指对人体施用某种可定位于肿瘤细胞的光敏物 质,然后以一定波长的光局部照射激活该物质,引发一系列的光化学和光生物学 进程,导致肿瘤细胞不可逆的光损伤。目前临床用的光敏物质是血卟啉衍生 物(HPD),其主要缺点是对皮肤光毒性作用时间长。在寻找替代光敏物质过程 中,金丝桃素以其显著的抗病毒作用和光动机制引起了人们的注意。金丝桃素离 体细胞毒性试验[34-351和活体抗肿瘤研究136’均有报道。光动作用是光化学治疗的 机制,包括光敏过程I和II。过程I首先产生媒介自由基,而后迅速被氧清除。 过程II接受光敏色素光活化提供的能量,产生细胞毒性很高的单线态氧。金丝桃 素光激发后主要采取过程II,余丝桃素分子由三线激发态跃迁到基态,引发单线一作为主要氧化剂,同时金丝桃素在激发态发生分子内质子转移和质子 释放,可使溶剂酸化,降低细胞内pH水平,这~过程可能参与金丝桃素的抗癌 作用。 Miskovsky[”]1995年研究报道,金丝桃素可直接引起癌细胞程序性凋亡, 并伴随由细胞色素C由线粒体向细胞质释放。Johnson[3811998年报道,1 P-mol/L 光活化的金丝桃素可导致细胞总ATP水平和线粒体呼吸功能显著而不可逆的下 降,提出线粒体可能是金丝桃素细胞光损伤的主要攻击目标。有关会丝桃素的抗 癌机制还待进一步研究。 5)贯叶连翘镇痛作用【39】 金丝桃甙在金丝桃素属植物中广泛存在,研究发现贯叶连翘中的金丝桃甙不 仅具有外周止痛作用,还具有中枢镇痛作用,这种作用可能与减少神经末梢ca2+ 内流,阻断中枢内Ca2十通道,降低脑内Ca2+含量有关。 1.1.4贯叶会丝桃素研究进展 1.1.4.1贯叶会丝桃素的药理作用 近年来,抑郁症发生率逐年升高,贯叶连翘以其独特的药理作用引起了世 人的关注。经研究证明,贯叶金丝桃素是贯叶连翘中抗抑郁的主要活性成分。1998年,Chatterjee[401等分别用贯叶连翘中的会丝桃素和贯叶连翘超临界 CO:萃取物(富含贯叶会丝桃素,不含有金丝桃素和其他极性组分)进行突触体 神经递质传导试验。研究结果表明,贯叶连翘的抗抑郁作用是通过抑制突触体间 隙中的单胺重吸收而实现的。贯叶金丝桃素是贯叶连翘提取物中抗抑郁的主要活 性成分。 Biberl41】等研究发现,贯叶连翘提取物的抗抑郁作用与贯叶金丝桃素的浓度 密切相关,从而进一步证明可以看出贯叶金丝桃素是抗抑郁的主要活性物质。实 验结果表明贯叶金丝桃素对于突触体对神经递质5一羟色胺(5一HT)、去甲肾上 腺素(NE)和多巴胺(DA)的重吸收有显著的抑制作用【421。贯叶金丝桃素诱导 人和小鼠的脑电图(EEG)变化与选择性单胺重吸收抑制剂(SSRIS)引起的特异 性变化相同【4引。 Kaehler[441等研究发现,给小鼠服用贯叶金丝桃素后,可明显提高其脑内细 胞外神经递质5一羟色胺(j--HT)、去甲肾上腺素(NE)和多巴胺(DA)的浓度。 与一般常用抗抑郁药不同,贯叶金丝桃素还可以抑制突触体Y一氨基丁酸(GABA) 和L一谷氨酸(L—glu)的重吸收【45J。 VeronJ ka[461等以老鼠为模型,分别用抗抑郁药丙咪嗪和贯叶金丝桃素进行 悬尾对照试验,发现贯叶会丝桃素与丙咪嗪的疗效相似,其使用剂量与疗效关系 呈u型曲线】等进行的试验结果表明贯叶会丝桃素对小鼠突触体神经递质 重吸收的抑制是非竞争性的。这与一般常用抗抑郁药的作用明显不同。 Muller[481等研究证实,贯叶金丝桃素与钠离子通道抑制剂的作用相似可以 提高胞内钠离子,从而抑制神经递质的重吸收.但它只能将但贯叶金丝桃素只将 细胞内钠离子浓度提高到细胞外钠离子水平,在加大剂量反而会降低细胞内钠离 子。贯叶金丝桃素的荆量一反应曲线呈“n”。贯叶金丝桃素不是单纯的钠离子 通道抑制剂。 研究结果表明由胞内H+--ATP+酶引起的突触小泡跨膜pH梯度是单胺重吸收 和存储的主要动力H91。MUller等认为贯叶金丝桃素的作用很可能是通过Na+一H +通道或影响细胞内pH实现的。Chatterjee[50I等经过实验研究发现,贯叶金丝 桃素可以和FCCP一样,使小泡内释放出质子从而降低跨膜pH梯度。Roz【5lJ等以 酸化的突触体为材料,在其中加入吖啶橙,在材料中加入mATP后,使突触小泡跨膜pH梯度增大,吖啶橙在493nm的荧光吸收明显降低,再加入质子偶联剂FCCP 或贯叶金丝桃素后,吖啶橙的吸收明显升高,贯叶金丝桃素的非竞争性抑制神经 递质重吸收的作用及对y氨基丁酸(GABA)和L--谷氨酸(L—glu)的抑制重吸 收很有可能是通过降低突触小泡跨膜pH梯度而实现的。 由于贯叶金丝桃素具有独特的药理作用,其提取工艺也是近两年研究的热 点。贯叶会丝桃素的提取工艺主要有两条。 第一条路线】: 贯叶连翘全草粉末—————+粗提物————,萃取液 制各色普 j硅胶枉层析 贯叶金丝桃素——一洗脱液 超临#C02革取乙醇收蹙 贯叶连翘全草粉术_—————j-萃取物———j-萃取液 l过滤 高纯度产品这两条路线都还在研究中,目前还没有贯叶金丝桃素工业生产工艺的报道。 国内关于贯叶金丝桃素的研究的报道很少,也未觅关于其提取工艺的报道。 贯叶金丝桃素十分不稳定,在氧气、光线和加热的条件下很容易氧化。据 文献报道,在室温和暴露在空气中的条件下,2小时内,贯叶金丝桃素固体就完 全被氧化。所以对其保存方法的研究也一直是热点。目前报道的保存方法有如下 几种:(1)将贯叶会丝桃素溶于甲醇,并加入B一环糊精,在.20。0T避光保存[54】。 (2)在装有贯叶金丝桃素的试剂瓶中充入氮气,在.70。C避光保存155】。(3)研究 发现,贯叶连翘在pH2.4的条件下较为稳定,故而可以在贯叶金丝桃素的甲醇溶 液中加入三氟乙酸,调pH至24,然后放置在.20"C保存‘561。在以上三种方法中, 在方法2的条件下,贯叶金丝桃素最为稳定。 1.2本课题的研究日的及意义I.2.I选题意义 随着社会的发展,生活节奏越来越快,竞争越来越激烈,人们的精神压力 也越来越大。2001年世界卫生组织发表的{2001年世界卫生报告》说,目前全 世界约有4.5亿各类精神和脑部疾病患者,抑郁症已成为世界第四大疾病,而到 2020年抑郁症可能会成为仅次于心脏病的第二大疾病。统计资料显示,美国抑 郁症的发病率仅次于心脏病。美国每年治疗抑郁症的费用高达440亿美元。我国 随着社会生活节奏的加快,精神疾病的患病率也呈逐年上升趋势。而现有的抗抑 郁广谱性能差.毒副反应较大,速蘸1000ppm的ABT或IBA溶液10秒且使用费用高。贯叶连翘提取物是一种即广谱有 效、毒副作用又较小的抗抑郁药,且使用费用也相对较低。所以,贯叶金丝桃素 以其抗抑郁作用填补精神治疗药物的空白,极具药用开发价值。 目前,贯叶连翘提取物已经成为治疗抑郁症的首选药,销售量是常用抗抑 郁药选择性5~羟色胺(5一HT)重吸收抑制剂氟西汀(Fluoxetine)的4倍。 在欧洲,贯叶连翘提取物的销售量从】996年至今一直排在植物药销售量的第二 名,仅次于银杏。在德国,以贯叶连翘为原料,生产出的治疗忧郁症药品,市场 销售额从1995年的几百万美元到i999年已达l,5亿美元。在美国,1997年以 前,贯日十连翘还不为入们所知,到了1997年贯叶连翘提取物的销量排在植物药 销售量排行榜的第5名,从1998年至今一直排在植物药销售量排行榜的第二名。 是最受欢迎的植物药之一。1995年,贯叶连翘在美国大型超市和商场中的销售 额(药房、天然产物与保健品专卖店及直销的销售渠道不包括在内)只有250 万美元,到了1998年.其销售额已达到3.9亿美元。 以往一般认为贯叶连翘提取物中的主要抗抑郁活性物质为金丝桃素及金 丝桃甙,而最新的药理学研究表明,贯时连翘提取物中的主要抗抑郁活性物质是 贯叶会丝桃素。我国贯叶连翘资源十分丰富,但是研究和开发利用却十分落后, 如国内对贯叶连翘的研究仍主要集中在余丝祧素和金丝桃甙上,而真正抗抑郁活 性成分的贯叶金丝桃素却缺乏研究。所以对贯叶连翘提取工艺的研究优化具有非 常大的社会价值和经济价值。 1.22研究目的本课题的研究目的就是提取出对贯叶连翘主要抗抑郁成分贯叶金丝桃素,制备 高纯度样品。并对其提取工艺进行初步的研究。 1.3本研究的主要内容 本文的主要研究内容是 1)贯叶会丝桃素薄层色谱和高效液相色谱定性定量分析方法的研究 2)贯叶金丝桃素的粗提取、分离、纯化方法的研究 3)使用制备薄层制备色谱和制备型加压液相色谱制备对照品及对照品的保存方 法研究 4)贯叶金丝桃素的ESI--MS鉴定及图谱分析 第二章贯叶金丝桃素定性定量分析方法的建立贯叶连翘在欧洲已有上千年的应用历史,在我国,它也是重要的传统中药材, 在诸多方面具有独特的药理作用和生物活性。在全球范围内被广泛的研究和应 用。贯叶连翘的药理活性成份众多,其成份的分析鉴定引起了人们极大的关注。 近几年的研究发现,贯叶连翘中抗抑郁的主要活性成份是贯叶金丝桃素。贯叶金 丝桃素的定性定量分析方法是贯叶连翘及其提取物质量标准的重要组成部分,具 有重要的研究价值。本文对贯叶金丝桃素的定性定量分析方法进行了研究,建立 了贯叶余丝桃素的薄层色谱定性分析方法和反相高效液相色谱定量分析的测定 方法。 2.1贯叶金丝桃素的高效薄层色谱定性分析方法的研究 薄层色谱是中草药定性分析的重要方法,也是中草药指纹图谱的重要组成 部分。薄层色谱利用混合物中各组分的物理和化学性质的差别,使各个组分以不 同程度分配在两个不混溶的相(流动相和固定相)中,随着流动相的流动,溶质 分子不断地在流动相和固定相之间重新分配和达到平衡,最终表现为各组分以不 同速度在固定相上迁移,从而达到分离各组分的目的。薄层色谱用于贯叶金丝桃 素的分离鉴别,具有实用、简便、费用低等特点,因此进行贯叶盒丝桃素薄层色 谱定性分析研究具有重要意义。 2.1.1实验部分 2.1.1.1主要试剂与仪器 甲醇, 分析纯, 乙酸乙酯, 分析纯, 双蒸水, 1810一B型 乙酸, 分析纯, 薄层层析硅胶GF254, 化学纯, 羧甲基纤维素钠(CMC),化学纯 上海陆都新化学试剂厂; 上海化学试剂有限公司; 全玻璃自动双重纯水蒸馏 器产出, 上海化学试剂有限公司: 青海海洋化工厂; 中国医药上海化学试剂公 旋转蒸发器,数显恒温水浴锅, 循环水式多用真空泵 电热干燥箱, 数控超声波清洗器. 三用紫外分析仪, 扫描仪, 点样仪, 薄层板(1010cm RE_85C, HH.2, SHB—III, CS.202一B KQ一400DB, ZF—I, CAMAGSCANNER3, CAMAGLINOMAT5, HPTLC—PattenNano.Sil20 Ij: 上海青浦泸西仪器厂: 常州国华电器有限公司; 郑州长城科工贸有限公司; 中国重庆银河试验仪器有限 公司; 昆山市超声仪器有限公司: 上海顾村: 瑞士CAMAG公司; 瑞士CAMAG公司; 德国MACHEREY.NAGEL 公司 2.1.1.2实验方法 1)薄层板的白行制备 配制O5%羧甲基纤维素钠水溶液,放置冷却,使用时取其上层清液。 预先取9块干燥清洁并厚薄相同的玻璃板(1020cm)首位相接,水平排 列于自动薄层铺板仪的层析板搁板上。 称取一定量的的薄层层析硅胶GF254,加2.5—3倍重量的的O.5%羧甲基纤 维素钠水溶液,调匀成浆糊状,并加入少许丙酮,倒入匀浆机混匀待用。 铺板时,将浆糊状硅胶倒入自动铺板仪的供浆槽内进行涂布即可。 铺好的薄层板置于水平位罱,阴干后,放入电热干燥箱,温度调至105, 活化30min后,取出放于干燥器中备用。 2)对照品溶液的配制 用分析天平精确称取贯叶金丝桃素对照品5.0mg,用甲醇溶解,定容至 10mL,经过O.45u mPP型(聚丙烯)WHATMAN一次性针头过滤器过滤,置于 超低温冰箱中冷藏备用。 3)样品溶液的制备 称取409贯叶连翘粉末,加240mL诈己烷,置于数控超声波清洗器中超声 处理30min后,滤去药渣,挥去溶剂至20mL,经过O.45 WHATMAN一次性针头过滤器过滤,作为样品溶液A。取溶液A进行制备薄层色谱分离,固定相为硅胶GF254,展开剂为诈己烷: 乙酸乙酯(4.5:1,v/v)。纯化得到样品溶液,经过0.45 Ia.mPP型(聚丙烯) WHATMAN…次性针头过滤器过滤,作为样品溶液B,保存在冰箱中。 取溶液A经硅胶柱层析分离,固定相为柱层析硅胶(140~160目),上样量 为15mL,洗脱剂为正己烷:乙酸zN(6:1,v/v),分步收集,合并相同组分, 得到的样品,经过O.45 mPP型(聚丙烯)WHATMAN一次性针头过滤器过滤,作为样品溶液c。 取溶液A进行硅胶干柱层析分离,固定相为薄层层析硅胶GF254,展丌剂 为『F己烷:乙酸乙酯(4.5:1,v~),上样量为8mL。得到的样品溶液,经过O.45 ”mPP型(聚丙烯)WHATMAN一次性针头过滤器过滤,作为样品溶液D。 样品溶液A、B、c和D均保存在超低温冰箱中。 展开前,将展开剂倒入层析缸中,预先饱和一段时间。本实验所有展开剂为新鲜配制。将上样后的硅胶薄层板放入到层析缸中,采用直立上行展开,展距约 为8cm。为摸索更为合适的展开条件,本文对多种展开剂进行了研究。 展开剂的配制‘57】 展开剂1正己烷一乙酸乙酯(9:1,“v) 展开剂2证己烷一乙酸乙酯(7:l,v/v) 展开剂3 正己烷一甲酸乙酯一叔丁基甲基醚(80:5:15,v/v/V) 展丌剂4『F己烷一乙酸乙酯(5:1,v~) 展丌剂5『F己烷一乙酸乙酯(4:l,v/V) 5)定位 展开后取出,挥干溶剂,在三用紫外分析仪254nm下直接观察。 2.1.2实验结果与讨论(1)典型色谱图 图2-1样品的高效薄层色谱图 Fig.2-1Higllthin-layerchromatogramofsample 在图2.1中,1为贯叶金丝桃素对照品溶液。粗提物中成分比较复杂,在薄 层板上显山4个明显的点。样品溶液B含有微量的杂质,在薄层上在高效薄层 E没有显示出来其它斑点。样品溶液C和D中的杂质在高效薄层上显示出了位置 稍高于对照品位置的点。由图2—1可以看出,贯叶金丝桃素和其他成分离效果良 (2)阿定相的选择硅胶为薄层色谱最常用的固定相,且在本实验条件下,贯叶连翘中的各主要 组分在适当的展开剂条件下都能很好地被分离分析,故本课题主要选择硅胶为固 定相。硅胶表面带有石丰醇基,呈弱酸性。通过硅原子上的一0H基与极性化合物和 或不饱和化合物形成氢键而表现其吸附能力,由于化合物的极性及不饱和程度的 不同形成的氢键的能力不同而得以分离。有效的硅醇基的数目越多,其吸附能力 越强,硅胶能吸附水分形成水合硅醇基而吸附能力降低,其活度也就降低了。在 一般条件下,待分离的物质极性较强,则使用活度较大即吸附能力弱的薄层板; 待分离的物质极性较弱,则使用活度较d目11吸附能力强的薄层板;因为贯叶连翘 粗提物中的主要成分都是亲脂性的,极性较低,故在本试验中使用的硅胶板在使 用前在105下活化30min,可达到常规的II ̄III级活度。吸附能力较强。 贯11f‘连翘粗提物中的各主要成份溶解在溶剂中,随着溶剂的向上展开,不断 的附着在吸附中心上,同时又被洗脱下来,由于各组分的化学结构不同,造成吸 附与解析的速度不同,随着逐渐展开,各组分得到分离,从而表现为它们在硅胶薄层板上的位置不同。 (3)展开剂的选择 展开剂的选择是高效薄层色谱中的关键技术。一般情况下,使用薄层色谱分 离极性大的化合物时,要采用极性大(Io大)的强洗脱剂展开;分离极性小的 化合物时,要采用极性小(E。小)的弱洗脱剂展丌i掘1。待测组分的比移值值应 当在O2—0.8之间。 在本试验中,根据样品的溶解特性和样品主要成分的极性,作者选用『F己烷 作为底剂,具有溶解作用和基本分离作用,使用乙酸乙酯作为选择性和极性调节 剂。在沈脱剂中,乙酸乙酯对被分离物质有较强的洗脱能力,帮助各组分在薄层 板上移动,可以增大Rf值,增加选择性。 对于正己烷粗提物样品溶液A,作者对几种展开剂进行了研究。 当用展开剂1,展开后薄层板上只有一点(未展开),说明其洗脱剂极性不 够,洗脱能力差。当用展开剂2和3时,展开后薄层板上成一条直线,各组分没 有分开。当用展丌剂4时,展开后薄层板上对照品的Rf值为O.41,符合待测组 分的Rf值应当在0.2~O.8之间的要求;粗提物样品溶液可见4个明显斑点,各 点达到了基线分离,比较合适。当用展开剂5.展开后薄层板上隐约见2个斑点, 且斑点都靠近展丌前沿,说明展丌剂极性过大,选择性不好。 由于贯叶连翘粗提物组分比较多且复杂,选择一个合适的展开剂就显得非 常重要,但由于组分的复杂性,这种展丌剂的选择比较困难。通过本论文工作的 摸索和比较,发现展开剂4(正己烷一乙酸乙酯(5:I,v/v))的展丌效果不错。 图2-2样品的薄层色潜图Fig,2-2 Thin layerehromatogmmofsample 由图2.1、幽2.2相比较可知,自制薄层板与高效薄层板相比,自制薄层 板可见少许拖尾(尤其在薄层板下部),点与点之间有时会连在一起,杂质含量 较小时无法检出。而样品溶液在高效薄层板的色谱图(图2.1)则斑点清晰,无 拖尾,点oj点之间可明显分开。作者对自制薄层板和进口的高效薄层板做了比较, 总的来说,自制的薄层板效果稍差,但是待测组分还是能得到较好的分离,对于 定性分折没有什么影响,可以满足定性分析的要求。高效薄层板虽然分离效果很 好,但是价格较贵,在本实验中需要用到大量的薄层板,为了降低成本,在[__1常 的定性分析中采用自制的薄层板作为高效薄层板的替代品。 2.2贯叶金丝桃素的反相高效液相色谱定量分析方法

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